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    新品發(fā)布丨華納生物寡核苷酸合成試劑上新啦!

    發(fā)布日期:2024-04-30 瀏覽次數:478


    合肥華納隆重推出寡核苷酸合成試劑,包括各種配方的脫保護劑、活化劑、加帽劑、氧化劑以及符合標準含水量的乙腈。能滿(mǎn)足用戶(hù)在藥物基因組學(xué)、診斷方法和藥物開(kāi)發(fā)等應用方面的需求,廣泛用于實(shí)驗室及批量生產(chǎn)規模的DNA/RNA 合成。歡迎新老客戶(hù)咨詢(xún)!

    寡核苷酸合成試劑知多少

    固相合成方法自1987年被Marvin H. Ca ruthers發(fā)明之后,因其具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應物比較穩定的特點(diǎn),被廣泛應用于分子生物學(xué)及醫藥研究等領(lǐng)域,目前已成為一項較為成熟的寡核苷酸合成方法。

    不同于酶促反應從5'端→3'端方向延伸的合成過(guò)程,固相亞磷酰胺法合成是由3'端開(kāi)始。在合成過(guò)程中除合成柱、核苷單體外,還需要用到合成輔助試劑:如脫保護劑、活化劑、加帽劑等等。今天我們一起來(lái)了解,在每一步反應中合成試劑的種類(lèi)及作用。

    一、脫保護(Deblocking)反應

    脫保護反應中使用三氯乙酸(TCA)去除核苷5'端位置上的 DMT保護基團,從而在5'端產(chǎn)生活性基團(-OH),以便于進(jìn)行后續的偶聯(lián)反應。

    圖1. 脫保護過(guò)程示意圖

    此步驟中會(huì )使用到脫保護試劑:二氯乙酸或三氯乙酸/二氯甲烷,二氯甲烷作為溶劑存在,二氯乙酸或三氯乙酸的濃度為3%,與核苷作用,使其產(chǎn)生活性基團(-OH)用于下一步偶聯(lián)反應。脫保護反應完成后,使用乙腈洗滌去除殘留的脫保護劑,以防止脫保護劑殘留產(chǎn)生雜質(zhì)。

    二、偶聯(lián)(Coupling)反應

    偶聯(lián)反應發(fā)生之前,需先將下一個(gè)亞磷酰胺單體與四氮唑(催化劑)混合后置入合成柱,四氮唑的作用是將3'端磷酸基團位置上的二異丙胺基質(zhì)子化,也稱(chēng)為活化。隨后,脫保護反應中產(chǎn)生的活性基團(-OH)會(huì )與活化后的四唑中間體結合,形成新的磷氧鍵,并脫去四唑。

    圖2. 偶聯(lián)過(guò)程示意圖

    此步驟中會(huì )使用到活化劑:5-乙巰基四氮唑/乙腈。四氮唑的作用是與核酸的亞磷酰胺單體反應生成活性中間體。

    三、加帽(Capping)反應

    加帽主要是為了防止未參與上一階段循環(huán)的活性基團(-OH)在新的循環(huán)中與新加入的亞磷酰胺單體發(fā)生偶聯(lián),產(chǎn)生短鏈雜質(zhì)。此步驟之前常使用加帽劑對未參與反應的活性基團(-OH)進(jìn)行端口封閉,避免其干擾下一輪循環(huán)。反應過(guò)程十分迅速,通常幾秒即可(這是因為需要加帽的活性基團(-OH)比較少,乙?;噭┑幕钚愿咔疫^(guò)量)。太長(cháng)的加帽時(shí)間會(huì )增加在非預期位置發(fā)生乙?;磻目赡苄?,增加乙酸酐與水形成酸攻擊新生成的亞磷酯鍵的危險性。

    圖3. 加帽過(guò)程示意圖

    此步驟中會(huì )使用到加帽劑,加帽劑分為2種,使用之前分開(kāi)存放。加帽試劑A(CapA),為醋酸酐;加帽試劑B(CapB)為N-甲基咪唑,作為?;磻拇呋瘎?。二者混合后會(huì )形成活性很強的活性試劑。

    四、氧化(Oxidizing)反應

    偶聯(lián)之后新的核苷酸通過(guò)亞磷酯鍵與寡核苷酸鏈相連,亞磷酯鍵不穩定且易被酸堿水解破壞,因此需要被氧化成穩定的五價(jià)的磷。被氧化后的磷酸二酯鍵在原有的磷酸二酯鍵外會(huì )多出一個(gè)2-氰乙基保護,使得其在后續的延伸過(guò)程中更加穩定。氧化過(guò)程通常采用碘的四氫呋喃溶液作為氧化劑,氧化結束后,延伸得到的寡核苷酸鏈繼續進(jìn)行下一輪循環(huán),直至鏈延伸至所需的長(cháng)度。

    圖4. 氧化過(guò)程示意圖

    注:圖1-4合成過(guò)程參考文獻:Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications.

    氧化反應步驟中會(huì )使用到氧化劑,常用的氧化劑為碘的四氫呋喃和吡啶、水的混合溶液,作用是將亞磷酰胺中間體轉化為磷酸三酯,得到穩定的寡核苷酸。

    當寡核苷酸鏈經(jīng)過(guò)以上四個(gè)步驟的多次循環(huán)達到所需的長(cháng)度時(shí),將合成的寡核苷酸鏈從固相載體上切割下來(lái),之后仍需對其進(jìn)行純化方能獲得成品。

    在上述合成反應中用到合成試劑需經(jīng)過(guò)特殊的純化工藝,滿(mǎn)足含水量、純度等技術(shù)指標,確保優(yōu)異的合成效率。所有的合成試劑也都要經(jīng)過(guò)嚴格的過(guò)濾,減少固體微粒的污染。在合成過(guò)程中選擇高品質(zhì)的合成試劑,也是寡核苷酸合成過(guò)程中高純度和高耦合效率的保障之一。

    關(guān)于華納生物

    合肥華納生物醫藥科技有限公司成立于2017年,致力于提供修飾性核苷、核苷酸、亞磷酰胺基因單體和熒光染料系列有關(guān)產(chǎn)品的研產(chǎn)銷(xiāo)一體化解決方案。公司在合肥循環(huán)經(jīng)濟示范園建立了GMP標準現代化生產(chǎn)基地。已經(jīng)通過(guò)多家國內外頭部企業(yè)的審計檢查??梢愿哔|(zhì)量長(cháng)期穩定供應噸級產(chǎn)品,確??蛻?hù)供應鏈安全。


    合肥華納隆重推出寡核苷酸合成試劑,包括各種配方的脫保護劑、活化劑、加帽劑、氧化劑以及符合標準含水量的乙腈。能滿(mǎn)足用戶(hù)在藥物基因組學(xué)、診斷方法和藥物開(kāi)發(fā)等應用方面的需求,廣泛用于實(shí)驗室及批量生產(chǎn)規模的DNA/RNA 合成。歡迎新老客戶(hù)咨詢(xún)!

    寡核苷酸合成試劑知多少

    固相合成方法自1987年被Marvin H. Ca ruthers發(fā)明之后,因其具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應物比較穩定的特點(diǎn),被廣泛應用于分子生物學(xué)及醫藥研究等領(lǐng)域,目前已成為一項較為成熟的寡核苷酸合成方法。

    不同于酶促反應從5'端→3'端方向延伸的合成過(guò)程,固相亞磷酰胺法合成是由3'端開(kāi)始。在合成過(guò)程中除合成柱、核苷單體外,還需要用到合成輔助試劑:如脫保護劑、活化劑、加帽劑等等。今天我們一起來(lái)了解,在每一步反應中合成試劑的種類(lèi)及作用。

    一、脫保護(Deblocking)反應

    脫保護反應中使用三氯乙酸(TCA)去除核苷5'端位置上的 DMT保護基團,從而在5'端產(chǎn)生活性基團(-OH),以便于進(jìn)行后續的偶聯(lián)反應。

    圖1. 脫保護過(guò)程示意圖

    此步驟中會(huì )使用到脫保護試劑:二氯乙酸或三氯乙酸/二氯甲烷,二氯甲烷作為溶劑存在,二氯乙酸或三氯乙酸的濃度為3%,與核苷作用,使其產(chǎn)生活性基團(-OH)用于下一步偶聯(lián)反應。脫保護反應完成后,使用乙腈洗滌去除殘留的脫保護劑,以防止脫保護劑殘留產(chǎn)生雜質(zhì)。

    二、偶聯(lián)(Coupling)反應

    偶聯(lián)反應發(fā)生之前,需先將下一個(gè)亞磷酰胺單體與四氮唑(催化劑)混合后置入合成柱,四氮唑的作用是將3'端磷酸基團位置上的二異丙胺基質(zhì)子化,也稱(chēng)為活化。隨后,脫保護反應中產(chǎn)生的活性基團(-OH)會(huì )與活化后的四唑中間體結合,形成新的磷氧鍵,并脫去四唑。

    圖2. 偶聯(lián)過(guò)程示意圖

    此步驟中會(huì )使用到活化劑:5-乙巰基四氮唑/乙腈。四氮唑的作用是與核酸的亞磷酰胺單體反應生成活性中間體。

    三、加帽(Capping)反應

    加帽主要是為了防止未參與上一階段循環(huán)的活性基團(-OH)在新的循環(huán)中與新加入的亞磷酰胺單體發(fā)生偶聯(lián),產(chǎn)生短鏈雜質(zhì)。此步驟之前常使用加帽劑對未參與反應的活性基團(-OH)進(jìn)行端口封閉,避免其干擾下一輪循環(huán)。反應過(guò)程十分迅速,通常幾秒即可(這是因為需要加帽的活性基團(-OH)比較少,乙?;噭┑幕钚愿咔疫^(guò)量)。太長(cháng)的加帽時(shí)間會(huì )增加在非預期位置發(fā)生乙?;磻目赡苄?,增加乙酸酐與水形成酸攻擊新生成的亞磷酯鍵的危險性。

    圖3. 加帽過(guò)程示意圖

    此步驟中會(huì )使用到加帽劑,加帽劑分為2種,使用之前分開(kāi)存放。加帽試劑A(CapA),為醋酸酐;加帽試劑B(CapB)為N-甲基咪唑,作為?;磻拇呋瘎?。二者混合后會(huì )形成活性很強的活性試劑。

    四、氧化(Oxidizing)反應

    偶聯(lián)之后新的核苷酸通過(guò)亞磷酯鍵與寡核苷酸鏈相連,亞磷酯鍵不穩定且易被酸堿水解破壞,因此需要被氧化成穩定的五價(jià)的磷。被氧化后的磷酸二酯鍵在原有的磷酸二酯鍵外會(huì )多出一個(gè)2-氰乙基保護,使得其在后續的延伸過(guò)程中更加穩定。氧化過(guò)程通常采用碘的四氫呋喃溶液作為氧化劑,氧化結束后,延伸得到的寡核苷酸鏈繼續進(jìn)行下一輪循環(huán),直至鏈延伸至所需的長(cháng)度。

    圖4. 氧化過(guò)程示意圖

    注:圖1-4合成過(guò)程參考文獻:Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications.

    氧化反應步驟中會(huì )使用到氧化劑,常用的氧化劑為碘的四氫呋喃和吡啶、水的混合溶液,作用是將亞磷酰胺中間體轉化為磷酸三酯,得到穩定的寡核苷酸。

    當寡核苷酸鏈經(jīng)過(guò)以上四個(gè)步驟的多次循環(huán)達到所需的長(cháng)度時(shí),將合成的寡核苷酸鏈從固相載體上切割下來(lái),之后仍需對其進(jìn)行純化方能獲得成品。

    在上述合成反應中用到合成試劑需經(jīng)過(guò)特殊的純化工藝,滿(mǎn)足含水量、純度等技術(shù)指標,確保優(yōu)異的合成效率。所有的合成試劑也都要經(jīng)過(guò)嚴格的過(guò)濾,減少固體微粒的污染。在合成過(guò)程中選擇高品質(zhì)的合成試劑,也是寡核苷酸合成過(guò)程中高純度和高耦合效率的保障之一。

    關(guān)于華納生物

    合肥華納生物醫藥科技有限公司成立于2017年,致力于提供修飾性核苷、核苷酸、亞磷酰胺基因單體和熒光染料系列有關(guān)產(chǎn)品的研產(chǎn)銷(xiāo)一體化解決方案。公司在合肥循環(huán)經(jīng)濟示范園建立了GMP標準現代化生產(chǎn)基地。已經(jīng)通過(guò)多家國內外頭部企業(yè)的審計檢查??梢愿哔|(zhì)量長(cháng)期穩定供應噸級產(chǎn)品,確??蛻?hù)供應鏈安全。

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